AMAMFSEu0006牛奶 氯霉素 HPLC法
AM-AM-FS-Eu-0006
HPLC分析牛奶中氯霉素
1.适用范围：
此方法由三部分组成：
用乙酸乙酯提取牛奶样品；
用氯仿-正己烷混合物净化提取液；
在C18柱UV278nm HPLC定量；
HPLC仪器：Waters 4um C18柱子（150*3.9mm）；UV检测器；Rheodyne进样器（7125）配200ul定量环。
牛奶样品，样品量必须足够大，能满足参考分析方法和如果需要重复分析，此方法，牛奶量不能少于30ml，在分析之前，收集后的牛奶必须冷冻储存≤-20℃。 这种方法用于进一步确认牛奶中氯霉素的存在，对于超高温灭菌牛奶氯霉素的检出限<1ug/L或kg。
2. 主要试剂和仪器
2.1.主要试剂：
冷冻离心机；
乙酸乙酯，分析纯。使用前用旋转蒸发器重蒸馏；
标准溶液：500ug/ml氯霉素甲醇溶液，4℃储存，最少稳定三个月；
中间液：用水稀释储存液，配成5和50ug/ml溶液。4℃储存，最少稳定两个星期；
工作溶液：当天使用，用水稀释中间液，浓度如下：10，20，50，100，125，250，500，1250，2500ng/ml；
甲醇，分析纯； 氯仿，分析纯；
正己烷，分析纯； 乙腈，HPLC级；
37%盐酸，分析纯。配成5mol/L溶液；
磷酸氢二氨，配成0.005mol/L溶液（每升0.66g）；
去离子水，电阻大于18MΩ cm，过活性碳和0.45um膜；
氯霉素纯度>99%结晶（Sigm）。
2.2.仪器：
可接真空泵的旋转蒸发器。
3.过程简述
3.1.采样：
3.2.样品制备：
3.2.1.在30℃水浴中解冻牛奶样品。
3.2.2.均质牛奶以便奶和奶油混合。
3.2.3.吸取5ml牛奶至50ml离心管中。
3.2.5.加入25ml乙酸乙酯，盖上盖混合提取。
3.2.4 加入50ul 5mol/L HCL溶液，搅拌10秒钟。
3.2.6 2400转离心5min。
3.2.7 吸取20ml有机相至50ml圆底烧杯中。
3.2.8 在30℃抽真空用旋转蒸发器蒸干。
3.2.9 加入1.6ml正己烷：氯仿（1：1 v/v）混合液，使残渣溶解，转移全部溶液至血球分离管中，加入0.8ml水，盖上盖，用试管振荡器高速振动15秒钟。
3.2.10 离心3300转，10分钟。
3.2.11 用注射器吸取250ul上清液，进HPLC。
3.3 回收试验：
3.3.1 分别吸取4.9ml不含氯霉素的牛奶到5个50ml离心管中。
3.3.2 加入0.1ml不同浓度的标准溶液，100，250，500，1250和2500ng/ml，因此5个牛奶样品浓度分别为2.5，10，25和50ng/ml。
3.3.3 搅拌混合15分钟。
3.3.4 按4.2.4至4.2.11步骤提取。
3.4 HPLC条件：
3.4.1 流动相：乙腈：0.005mol/L NH4HPO4(18:82，v/v)
3.4.2 流速：1ml/min。
3.4.3 波长：278nm。
3.4.4 氯霉素保留时间大约10分钟。
4. 结果计算：
4.1.标准曲线：
注射包含10，25，50，125和250ng/ml工作液，与添加回收牛奶中2，5，10，25和50ng/ml含量相同，从标准曲线，检测检测器响应的线性范围。
4.2.从添加提取所得结果计算回收率，对于浓度范围2-50ng/ml，回收率的平均值93.2±4.7%。
4.3.通过标准曲线、回收率和可能的稀释倍数，计算样品中氯霉素的浓度。
A——样品中氯霉素的峰面积或峰高
Ae——标准中氯霉素的峰面积或峰高
Ce——标准的浓度
4.4. 详细说明：样品色谱图与添加回收牛奶谱图一致，在氯霉素保留时间上，不能有干扰。
4.5. 精密度
在牛奶样品中添加四种浓度的氯霉素，做回收实验其数据如下：
方法精密度
理论值 测定值 SD CV 回收率
（ng/ml） （ng/ml） （ng/ml） （%） （%）
2 2.01 0.09 4.46 100.3
5 4.62 0.21 4.42 92.5
10 9.35 0.08 0.82 93.6
25 22.71 0.05 0.24 90.9
50 44.45 0.55 1.23 88.9
6.来源：
欧盟食品分析方法CY3.7
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